Спикеры

Председатель пленарной сессии. Со-председатель круглого стола по использованию NGS в клинической практике.

Изменение характера медико-генетического консультирования (консультирование вариантов). Новые навыки и умения генетика-консультанта. Схема организации консультирования при использовании секвенирования нового поколения. Консультирование до геномного тестирования. Чему надо научить генетика-консультанта. Чему надо научить консультирующегося. Консультирование после геномного тестирования. Будем ли мы когда-нибудь консультировать случайные находки сиквенса? Как подготовить врачей-генетиков к консультированию в геномную эру.

Будут обсуждаться этические проблемы, связанные с получением при полногеномном/полноэкзомном анализе "неожиданных находок" мутаций с известным патогенным эффектом, вариантов с неустановленным клиническим значением, тестированием несовершеннолетних. Акцент будет сделан на особенностях претестового консультирования пациентов, информированного согласия, гарантий конфиденциальности генетических данных.

Причины невыявления мутаций при NGS-анализе. Примеры описания непатогенных изменений нуклеотидной последовательности как мутаций: причины, способы избежать ошибок. Рекомендации по использованию баз данных и номенклатуре. Рекомендации по оформлению результатов NGS-анализа.

Наследственные болезни обмена веществ относятся к уникальной категории заболеваний для которых основными методами диагностики являются биохимические. В рамках выступления будут обсуждены возможные точки приложения NGS в диагностике НБО, в поиске новых форм наследственных заболеваний, ограничения и преимущества метода. Будут приведены результаты собственных исследований по применению NGS в диагностике митохондриальных болезней, поиске возможных причин метаболических нарушений.

Моногенные болезни нервной системы одна из наиболее многочисленных групп наследственной патологии человека, характеризующаяся тяжелым прогрессирующим течением и отсутствием значимого терапевтического эффекта. Выраженная гетерогенность заболеваний, сходных по клиническим проявлениям, существенно затрудняет диагностику отдельных генетических вариантов, которая необходима для расчета риска и осуществления профи-лактики возникновения повторных случаев заболевания в отягощенных семьях. Секвенирование экзома, в результате которого одновременно тестируются нуклеотидные последовательности большого количества генов, позволяет значительно повысить эффективность диагностики, однако, существующие ограничения метода, а также обнаружение впервые выявленных нуклеотидных замен, затрудняет трактовку полученных результатов. В докладе будет дан анализ эффективности и целесообразности использования секвенирования экзома для различных групп наследственных болезней нервной системы, представлена презентация нескольких панелей генов, разработанных в клинике Геномед, и проведены примеры трактовки результатов секвенирования экзома у нескольких больных с нервно-мышечной патологией.

Наследственные заболевания сердца и сосудов, для которых ДНК-диагностика рекомендована международными кардиологическими и хирургическими сообществами: первичные нарушения сердечного ритма, первичные кардиомиопатии, наследственные нарушения эластических свойств сосудистой стенки. Использование NGS в клинической практике в настоящее время требует решения широкого круга вопросов: определения показаний к такого рода исследованию, выбор объёма исследования (панель генов, экзом, геном), валидация и интерпретация результатов. В лаборатории медицинской генетики ФГБНУ РНЦХ им. акад. Б.В.Петровского выполняется диагностическое секвенирование панелей генов при гипертрофической кардиомиопатии и первичных нарушений ритма сердца, а также медико-генетическое консультирование пациентов, обратившихся за интерпретацией результатов NGS, которое было выполнено в других учреждениях. Ограничения по покрытию приводят к необходимости широкого использования сенгеровского досеквенирования, что сильно снижает ожидаемое преимущество NGS в себестоимости. В условиях ФГБНУ РНЦХ частота госпитализаций с диагнозом первичная ГКМП и/или СНМЛЖ – 1-2 новых пациента/нед. Частота обращений больных с первичными аритмиями – 1-2 пациента в неделю. Если «набирать» больных для максимального «заполнения» чипа, ожидаемое преимущество NGS в скорости исследования сходит на «нет» или «почти нет». При наличии чёткой клинической гипотезы секвенирование «таргетной панели генов» пробанду может быть полезно в том случае, если ограничения качества результатов NGS представлены в явном виде. В отсутствие чёткой клинической гипотезы секвенирование «клинического экзома» в формате «трио» может быть предложено в том случае, если ограничения качества результатов NGS представлены в явном виде. Целесообразность секвенирования генома в диагностических целях не показано даже в формате «трио».

Факоматозы - группа наследственных, прогрессирующих заболеваний, характеризующихся сочетанным поражением кожи, глаз, нервной системы и внутренних органов. До недавнего времени ДНК-диагностика факоматозов представляла собой серьёзную проблему по целому ряду причин. Заболевания этой группы могут вызываться мутациями более чем в одном гене (например, нейрофиброматоз – NF1, NF2; туберозный склероз – TSC1, TSC2). Отсутствие «горячих точек» заставляет проводить в поисках мутации скрининг всех экзонов этих генов (72 экзона для нейрофиброматоза, 63 экзона для туберозного склероза). Высока частота случаев мозаичных мутаций, вследствие чего секвенирование по Сэнгеру в диагностике факоматозов теряет лавры «золотого стандарта» ДНК-диагностики. Перечисленные проблемы решаются высокопроизводительным параллельным секвенированием ДНК – методом, позволяющим проводить одновременный поиск мутаций в значительном количестве генов, причём каждая молекула ДНК анализируется индивидуально, что обеспечивает эффективное выявление минорных клонов (мозаичных мутаций).

Обзор современных методов NGS. Возможности, ограничения. Базовые представления о протоколе работы.

В докладе будут представлены результаты секвенирования экзомов 500 пациентов из когорты российского эпидемиологического проекта АТЕРОГЕН-ИВАНОВО, направленного на поиск генетических факторов развития атеросклероза, гиперхолестеринемии и ожирения. Показаны основные проблемы при проведении подобных исследований и пути их решения. Подробно разобран pipeline биоинфоорматического анализа и представлены основные результаты. Разобраны применяемые в проекте статистические тесты для выявления ассоциаций c фенотипом редких и уникальных мутаций: Single-Variant Tests, Multiple-Variant Tests (CAST, CMC) и Variance-Component Tests (СКАТ).

Описание основных программ выравнивания прочтений и поиска вариантов. Представление результатов их работы в различных комбинациях - чувствительность, специфичность, точность. Описание независимой платформы для сравнения пайплайнов - PrecisionFDA. Представление рекомендаций.

В докладе будет представлен обобщенный анализ результатов поиска причин моногенных заболеваний у 1000 пациентов, для которых в медико-генетическом центре "Геномед" выполнено полноэкзомное секвенирование, клиническое секвенирование экзома или таргетный анализ генных панелей.

Биоинформатический анализ данных полноэкзомного секвенирования (whole-exome sequencing, WES) представляет собой многостадийную и непростую задачу. На данный момент существует немало подходов к ее решению, но пока нельзя утверждать, что сформировался "золотой стандарт" обработки данных WES. Формально задачу можно разделить на несколько глобальных стадий: 1) контроль качества секвенирования; 2) выравнивание прочтений на референсный геном; 3) определение вариантов; 4) аннотация вариантов по клинической значимости; 5) поиск вариантов, объясняющих исследуемый фенотип. Мы рассмотрим на конкретных примерах, как извлечь максимум информации из эксперимента и избежать известных "подводных камней", встречающихся при анализе. Мы также попробуем сформулировать правила для достижения оптимального соотношения цена-качество при полноэкзомном секвенировании. Наши результаты демонстрируют преимущества подхода, в котором биоинформатики работают в тесном сотрудничестве и активно обмениваются информацией с экспериментальной лабораторией, на примере совместных проектов с РЦ "Центр Биобанк" НП СПбГУ.

Технологии NGS применимы для изучения гетероплазмии мтДНК, поскольку позволяют оценить даже очень низкий уровень точковых мутаций. В докладе будут представлены результаты сравнительного исследования гетероплазмии мтДНК в крови и атеросклеротических бляшках сонных артерий с помощью технологии Illumina. Описан спектр мутаций и уровень гетероплазмии, выявлена повышенная частота миссенс-мутаций и мутаций в некодирующей области мтДНК. Охарактеризована специфика анализа мтДНК с помощью методов NGS - трудности в оценке гетероплазмии делеций и инсерций, артефакты выравнивания, детекция контаминации.

На платформе NGS была разработана система, позволяющая детектировать "точковые" мутации, а так же небольшие делеции/дупликации в протяженных генах. Использование данной системы уменьшает стоимость исследования и увеличивает его точность относительно использования полноэкзомого анализа или "панелей генов". Данную систему рекомендуется применять в случае частых заболеваний с характерной клиникой, обусловленных мутациями в протяженных генах или в группе генов. Эффективность разработанной системы была показана на примере исследования ДНК больных с миодистрофией Дюшенна/Беккера.

Впервые семья, включающая 146 случаев рака толстой кишки, желудка или эндометрия у родственников из нескольких поколений, была описана еще в 1913 году в США и получила обозначение "семья G". Впоследствии эта (самая известная в мире) "раковая семья" была отнесена к семьям с синдромом Линча, для которых и характерны наследственные случаи колоректального и других видов рака. Вызывается данный синдром герминальной мутацией в одном из генов репарации неспаренных оснований (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 и ряд других). Другим тяжелым наследственным синдромом со 100%-м риском малигнизации является семейный аденоматоз толстой кишки. Он характеризуется развитием сотен колоректальных полипов уже с возраста 10-20 лет и обусловлен герминальными мутациями генов APC и MYH. Все описанные и некоторые другие гены изучаются уже у российских пациентов в отделе и кабинете лабораторной генетики ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава РФ. В том числе и с помощью NGS…

Использования NGS-подходов в медицинской генетике позволило не только повысить эффективность ДНК-диагностики, но и существенно продвинуться в выявлении новых генов ответственных за возникновение моногенных заболеваний. Однако при решении этих задач уже недостаточно одного секвенирования генома или экзома больного, необходим очень важный дополнительный этап - функциональный анализ выявляемых мутаций. Несмотря на огромную вариативность в функциях генов, на сегодняшний день для любого случая можно разработать систему in vitro анализа, позволяющую доказать или опровергнуть патогенность мутации.

Таргетное секвенирование является перспективным методом подтверждающей диагностики наследственных моногенных заболеваний. В докладе будет обобщен собственный опыт внедрения валидированной тест-системы для диагностики частых наследственных заболеваний в практику нескольких клинических лабораторий. Акцент будет сделан на различиях в подходах к созданию и использованию MPS-решений в медицинских исследованиях и рутинной диагностике.

Технология NGS дает возможность создавать гибкие диагностические решения, варьируя состав панелей, способы таргетного обогащения, методы и глубину секвенирования. Однако, это серьёзно ограничивает возможности кросс-валидации результатов и сравнения данных. Таким образом, универсальная система оценки надежности результатов NGS-исследования является важным инструментом для широкого внедрения NGS в клиническую практику. Зачастую биоинформатические пайплайны позволяют оценить «надежность» выявленных мутаций. Однако, эта величина рассчитывается и представляется по-разному разными алгоритмами, и к т ому же сложно интерпретируема с клинической точки зрения. Проблема стоит еще острее в отношении «нормального» генотипа: медицинский генетик, имея дело с данными NGS-исследования, не получает информации о вероятности «упустить» клинически-значимые мутации. Авторами разработано программное обеспечение, позволяющее оценивать «клиническое качество» данных NGS независимо от использованного метода секвенирования и особенностей таргетной панели. Для каждого образца вычисляется предсказанные чувствительность (вероятность того, что клинически значимые мутации не упущены) и специфичность (вероятность того, что обнаруженные мутации не являются ложно-положительными). Помимо технических параметров секвенирования алгоритм может учитывать популяционные частоты клинически значимых мутаций, таким образом, он корректно переводит биоинформатические параметры на «язык» клинической диагностики. С помощью разработанного ПО было обнаружено, что в наборе данных полно-экзонного анализа генов BRCA1 и BRCA2, предсказанная диагностическая чувствительность в некоторых случаях составляла мене 98%. Это указывает на необходимость для отдельных пациентов дополнительно исследовать определенные участки, потенциально содержащие клинически значимые мутации. Помимо оценки качества данных конкретного пациента с помощью предложенного подхода можно также проводить сравнения как различных платформ и конкретных протоколов секвенирования, так и алгоритмов анализа данных.