Докладчики

.

В сообщении представлены современные взгляды на этиопатогенез наследственных вариантов гипогонадотропного гипогонадизма (ГГ). Обобщен собственный опыт использования NGS при обследовании более 300 пациентов с ГГ. Обсуждаются особенности наследственного ГГ, сочетающегося с дефицитом других тропных гормонов аденогипофиза (дефекты гена PROP1), а также изолированных вариантов ГГ (дефекты генов KAL1, FGFR1, GNRHR и др.). Представлены случаи ГГ, в основе которых по результатам NGS можно предположить дигенное или олигогенное наследование. На примере нескольких семейных случаев с неуточненной этиологией заболевания обсуждаются перспективы полноэкзомного секвенирования для выявления новых генов, задействованных в этиопатогенезе ГГ.

Высокопроизводительное секвенирование (ВПС) — мощный и экономически эффективный инструмент для анализа генетической основы наследственных заболеваний человека. Его внедрение в клиническую практику врача-генетика произвело революцию в диагностике. Все более активное использование ВПС позволило выявить новые ассоциации между заболеваниями и мутациями в ранее неописанных генах и способствовало решению многих диагностических загадок. Тем не менее, одним из основных источников как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов в диагностике с использованием методов ВПС являются ошибки в интерпретации значимости выявленных вариантов нуклеотидной последовательности. Основой для принятия решения о роли того или иного варианта в развитии заболевания, наблюдаемого у пациента, являются критерии Американского колледжа медицинской генетики и Ассоциации молекулярной патологии, в том числе их локально адаптированные версии. Несмотря на свою простоту и ясность, они зачастую применяются неверно, что порождает ошибочно поставленный диагноз для пациента, а также отсутствие указаний на продолжение диагностического поиска для врача. Противоположной ситуацией бывает недооценка значимости выявленного у пациента варианта нуклеотидной последовательности, что может приводить к его обращению за проведением дорогостоящего функционального анализа, который в таком случае может быть избыточным с клинической точки зрения. На семинаре будут разобраны несколько примеров ошибочного применения критериев оценки патогенности выявленных вариантов нуклеотидной последовательности с помощью методов ВПС у пациентов с наследственной патологией, вероятные причины их возникновения, а также даны практические рекомендации их применения.

.

Синдром Туретта (СТ) -- генетически обусловленное расстройство центральной нервной системы, которое проявляется в детском возрасте и характеризуется множественными моторными тиками и как минимум одним вокальным тиком. СТ характеризуется высокой наследуемостью, однако генетические факторы риска синдрома до сих пор не установлены. Нами был проведен анализ вариантов числа копий (ВЧК) у 2,434 случаев ТС и 4,093 контролей. У больных СТ по сравнению с контролями наблюдается избыток больших (>1Мб) редких или ранее известных патогенных ВЧК. Было обнаружено, что делеции в локусе гена NRXN1 и дупликации CNTN6 существенно повышают риск развития СТ. В независимом исследовании на основе анализа предположительно патогенных de novo вариантов в экзомах 511 семейных трио были идентифицированы четыре гена (WWC1, CELSR3, NIPBL, FN1), дающих существенный вклад в риск развития синдрома. Установлено, что в целом de novo варианты в 400 генах могут быть ответственными за развитие синдрома примерно в 12% случаев.

Использование результатов секвенирования экзома в практической работе врача, безусловно, существенно повысило эффективность диагностики, моногенных заболеваний, особенно, редких генетических вариантов или обусловленных мутациями в генах большого размера, диагностика которых ранее проводилась крайне редко в связи со значительными экономическими затратами. Однако основные успехи достигнуты в диагностике нозологических форм, характеризующихся локусной гетерогенностью, в то время как диагностика аллельных вариантов наследственных заболеваний, все еще вызывает определенные трудности и обуславливает необходимость тесного взаимодействия врача, наблюдающего больного, и биоинформатика, трактующего результаты секвенирования. Увеличение количества аллельных вариантов заболеваний, обусловленных мутациями в одном и том же гене, клиническая картина которых существенно отличается, а также выявления значительного количества ранее не описанных нуклеотидных замен, требует тщательного анализа литературных данных. Кроме того, отдельные мутации в гене могут приводить к появлению вариабельных по возрасту манифестации и тяжести клинических вариантов одного и того же заболевания. Причиной этого могут быть различия во влиянии мутации на функцию белкового продукта гена. Однако к настоящему времени для абсолютного большинства генов функциональная значимость отдельных мутаций не установлена, что создает проблемы для врача- генетика при проведении медико-генетического консультирования отягощенных семей, так как не позволяет прогнозировать тяжесть течения заболевания у пробанда, а также препятствует разработке персонифицированного лечения. На протяжении семинара будут: 1. Представлены клинико-генетические характеристики аллельных вариантов, обусловленным мутациями в генах DYNC1H1 и SCN2A и обсуждены, предполагаемы механизмы появления аллельных вариантов, различных по клиническим проявлениям. Показаны различия терапевтических подходов при лечении больных с эпилепсиями, обусловленными мутациями в генах ионных каналов. 2. Продемонстрированы примеры изменения диагноза, с которым длительное время наблюдался больной, на основании результатов секвенирования экзома, а также случаи диагностики редких вариантов наследственных синдромов, симптомы которых при клиническом осмотре не были выявлены врачом. 3. Продемонстрирована роль хромосомного микроматричного анализа в диагностике моногенного заболевания на примере ранней эпилептической энцефалопатии 6 типа, обусловленной мутациями в гене SCN1A.

Полногеномное секвенирование без амплификации предоставляет уникальные возможности для обнаружения структурных вариантов, экспансии тринуклеотидных повторов и митохондриальной гетероплазмии. В этом докладе будет описана схема, которая была создана для обнаружения, анализа, интерпретации и отчета об этих классах вариантов при секвенировании образцов пациентов с редкими заболеваниями. Данная схема привела к улучшению диагностической эффективности.

На примере выборки лаборатории "Геномед" (более 5000 случаев) будут показаны текущие данные о выявляемости вероятных причин заболеваний в основных группах пациентов, разделенных по направительному диагнозу. Особый акцент в докладе будет сделан на анализе вариаций числа копий, обеспечивающем определенную долю положительных результатов. Чего ожидать при направлении на анализ пациента с тем или иным диагнозом? Какие причины заболеваний встречаются чаще, а с чем лаборатория и биоинформатик не ожидают столкнуться? Что может быть упущено при анализе? Будут подробно освещены эти и многие другие вопросы, волнующие практиков клинической диагностики на основе NGS.

Мотивация и цели: Несмотря на успехи полноэкзомного секвенирования в диагностике менделирующих заболеваний, на сегодняшний день ~50–75% пациентов не получают молекулярно-генетического диагноза. Одна из причин кроится в сложности биоинформатического выявления патогенных вариантов нуклеотидной последовательности, особенно в некодирующих областях генома. Известно, что мутации сплайсинга могут являться причиной развития генетических заболеваний. Однако из-за сложности регуляции процесса сплайсинга трудно предсказать точное влияние конкретных нуклеотидных вариантов на образующуюся структуру РНК. В нашей работе мы сосредоточились на функциональном анализе мутаций, нарушающих сплайсинг, при различных менделирующих заболеваниях. Методы: Для экспериментального определения влияния на сплайсинг каждого варианта нуклеотидной последовательности мы использовали 2 подхода: (1) ОТ-ПЦР РНК, выделенной из доступных образцов тканей пациентов; (2) использование системы минигена in vitro. Для различных случаев мы использовали один или оба подхода. Результаты: Мы проанализировали более 30 ранее не охарактеризованных вариантов нуклеотидной последовательности в 12 генах, связанных с развитием различных менделирующих заболеваний. Данные варианты локализуются как в интронах, так и в экзонах и во многих случаях были классифицированы как варианты с неизвестным клиническим значением (VUS). Мы экспериментально определили влияние этих мутаций на структуру мРНК, что позволило нам реклассифицировать большинство из них в патогенные, а также сделать предположения о механизмах, участвующих в молекулярном патогенезе заболевания (нонсенс-опосредованная деградация РНК, нарушение структуры белка). Заключение: Известно, что мутации сплайсинга могут приводить к развитию менделирующих заболеваний, однако их вклад в структуру заболеваемости на сегодняшний день недооценен из-за несовершенства диагностических процедур. Поэтому для подтверждения патогенности таких мутаций часто необходимо проводить функциональный анализ.

Введение. В настоящее время в мире известно более 3000 мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Распространенность мутаций генов BRCA1 и BRCA2 значительно варьирует в зависимости от принадлежности к этническим группам и географическому региону. Особенность спектра мутаций в России заключается в преобладании пяти частых мутаций (c.5266dupC, c.181T>G, c.66_67delAG, c.4035_4035delA, c.1961_1961delA), которые охватывают до 90% всего спектра. С наибольшей частотой у женщин, проживающих в достаточно отдаленных друг от друга регионах России, встречается одна из этих мутаций — c.5266dupC в экзоне 20 гена BRCA1 (от 68 до 90%). На основе этих данных разработаны и внедрены в клиническую практику коммерческие наборы на основе метода ПЦР для детекции наиболее частых мутаций генов BRCA1 и BRCA2. Однако на настоящий момент такой подход не является оптимальным, так как в этом случае не учитываются редкие мутации и этническая принадлежность пациента. В данной работе мы проанализировали частоту мутаций генов BRCA1 и BRCA2 у пациенток с синдромом наследственного рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ) и дали характеристику редким мутациям перечисленных генов. Материалы и методы. Методом секвенирования нового поколения (NGS) были проанализированы гены BRCA1 и BRCA2 в 633 образцах крови от пациенток с наследственным РМЖ и РЯ, проходивших обследование в различных учреждениях онкологического профиля РФ в 2014-2018 гг. и подписавших информированное согласие на проведение исследования. Критерии включения были следующими: молодой возраст возникновения РМЖ (до 40 лет), отягощенный семейный анамнез (наличие одного и более РМЖ или РЯ у родственниц первой или второй линии родства). ДНК из лейкоцитов периферической крови выделяли с помощью набора DNeasy Blood & Tissue Kit («Qiagen»). Концентрация ДНК была измерена на спектрофотометре NanoVue Plus («GE Healthcare») и составляла 30-50 нг/мкл. Подготовка библиотек для секвенирования осуществлялась с помощью NimblGen SepCapEZ Choice («Roche»). Секвенирование проводилось на приборе Illumina MiSeq («Illumina»). Картирование прочтений на референсную последовательность генома человека (hg19) проводилось при помощи алгоритмов BWA-MEM, качество исходных данных, выравнивания, обогащения и покрытия целевых регионов проверялось с помощью FastQC, BAMQC и NGSrich. Поиск нуклеотидных вариаций выполнялся с помощью GATK HaplotypeCaller, Samtools, FreeBayes. Полученные VCF-файлы всех комбинаций алгоритмов выравнивания и поиска вариаций объединялись методом опорных векторов, что увеличивало общие показатели чувствительности и специфичности при выявлении мутаций. Консенсусный VCF-файл обрабатывался с помощью программы SnpSift (глубина прочтения более 10) и аннотировался с помощью SnpEff (анализ всех транскриптов), ANNOVAR (анализ частот аллелей в ExAC, 1000G и ESP6500, алгоритмы проверки функциональной значимости SIFT, PolyPhen2, MutationTaster, FATMM, CADD, DANN, Eigen) и Alamut Batch (влияние на сплайсинг, базы данных dbSNP, ClinVar, HGMD Professional). Среднее покрытие составило 473x, доля корректно картированных прочтений – 99,6%, доля целевых регионов с покрытием выше 100x – 96,2%. Результаты и обсуждение. В результате секвенирования 633 образцов пациенток с наследственным РМЖ и РЯ было выявлено 175 патогенных и 14 предположительно патогенных мутаций. Самой частой мутацией, как и ожидалось, оказалась NM_007300.3:c.5329dup (21% всех мутаций). Суммарная доля мутаций, считающихся частыми и представленных в коммерческих наборах на основе ПЦР, составила 30%. Таким образом, для большинства пациенток (70%) из выборки результаты анализа ПЦР методом будут неинформативными. Второй по частоте встречаемости оказалась мутация NM_000059.3:c.7544C>T гена BRCA2, которая на настоящий момент не входит в ПЦР панели диагностических тестов. Возможно, такая высокая частота мутации объясняется преобладанием пациенток татарского этноса. Подобное предположение говорит в пользу версии о различии мутаций генов BRCA1 и BRCA2 в разных этнических группах и необходимости анализа всей области гена BRCA1 и гена BRCA2. 34% пациентов в выборке имели редкие мутации, встречаемость которых в выборке не более одного раза. Это сравнительно большое количество носительниц мутаций, которое можно выявить только методом NGS. Выводы В результате NGS анализа образцов от 633 пациентов было выявлено 175 патогенных и 14 предположительно патогенных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Большинство из этих мутаций не входит в ПЦР панель коммерческих наборов для выявления наследственных мутаций РМЖ и РЯ. Вторая по частоте встречаемости оказалась мутация NM_000059.3:c.7544C>T гена BRCA2. С появлением все большего массива данных о встречаемости и представленности наследственных мутаций РМЖ и РЯ возрастает необходимость использования NGS для секвенирования генов BRCA1 и BRCA2.

.

.

.