Докладчики

.

.

.

Дегенерация сетчатки глаза происходит как в связи с возрастом, так и в результате наследственных патологий. Клинически сходная картина часто бывает связана с различными молекулярными путями и генными мутациями. Арсенал клинических средств терапии для таких больных очень ограничен. Современные достижения в области репрограммирования клеток и редактирования генома позволяют использовать персонализированный клеточный продукт. В настоящем исследовании нами получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) от пациентов с клиническим диагнозом болезнь Штаргардта, определена мутация в гене периферина 2 и показано, что мутация не влияет на эффективность дифференцировки в пигментный эпителий сетчатки. Используя CRISPR/Cas9 систему, проведено редактирование генома в иПСК пациента. В результате получены изогенные линии иПСК с исправленной мутацией для создания модели заболевания in vitro и потенциально пригодные для персонализированной терапии болезни Штаргардта.

Муковисцидоз – тяжелое аутосомно-рецессивное заболевание, вызываемое мутации в гене CFTR, наиболее частой из которых является F508del. В рамках проекта по разработке эффективного способа коррекции этой мутации мы использовали разные комбинации sgRNA и ортологов Cas9. При этом sgRNA (sgCFTR#1), подобранная непосредственно на мутацию F508del для spCas9, оказалась наименее эффективной (13,8%), что связано с ее низкой экспрессией, по сравнению с другими sgRNA. В работе были предприняты попытки увеличения экспрессии sgCFTR#1 с помощью разных подходов, а также стабилизация этой направляющей РНК. Вероятно, низкая эффективность работы sgCFTR#1 является следствием ее нуклеотидной последовательности, что ограничивает ее применение и заставляет использовать другие ферменты Cas9, которые расширяют способность выбора sgRNA непосредственно к мутации F508del.

Синдром Дауна (СД) является самой распространенной геномной патологией человека. Набор патологий сопровождающих СД включает в себя широкий спектр заболеваний, таких как наследственная предрасположенность к миелоидному лейкозу или болезни Альцгеймера. Для подробного изучения механизмов возникновения этих патологий и поиска путей их компенсации, необходимы адекватные клеточные модели in vitro. Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в качестве базы для таких моделей весьма актуально, поскольку это позволяет получать in vitro в неограниченных масштабах культуры клеток (например нейроны) получение которых из организма взрослого донора невозможно. В наших исследованиях мы разработали модель получения нейронов с трисомией 21-й хромосомы (T21) и показали, что они воспроизводят в культуре ранние этапы болезни Альцгеймера. Также при помощи анализа транскриптомных данных, мы убедились в наличии дисбаланса экспрессии генов в различных культурах клеток с T21 по сравнению со здоровым контролем.

Системы CRISPR-Cas широко распространены у бактерий и архей и подразделяются на два основных класса, а также несколько типов и подтипов. Системы второго класса имеют единственный эффекторный белок, осуществляющий связывание и разрезание мишени. Несмотря на разнообразие CRISPR-систем и быстро растущее число приложений этой технологии, репертуар используемых эффекторных белков пока что довольно скромен, а сами белки имеют ряд ограничений. В докладе будут описаны используемые на сегодняшний день эффекторы и работы по поиску новых представителей этого класса белков.

Мышечные дистрофии характеризуются первичным поражением мышечной ткани, развивающимся непрерывно-прогредиентно, зачастую приводя к инвалидности в трудоспособном возрасте, а также к смерти в детском и подростковом возрасте. Общая распространенность мышечных дистрофий составляет 19.8-25.1:100000, наиболее распространенная - миодистрофия Дюшенна (1:3300 новорожденных мальчиков), а также высоко распространена группа поясно-конечностных мышечных дистрофий (от 1:14500 до 1:123000). Этиотропного лечения этих заболеваний на сегодняшний день не существует. Учитывая то, что миодистрофии вызваны мутациями в генах, кодирующих мышечные белки, наиболее оптимальным подходом является генная терапия, позволяющая корректировать генетический материал клетки (РНК или ДНК). В исследованиях по разработке генной терапии мышечных дистрофий возникает необходимость рассмотреть тот или иной подход (редактирование ДНК, РНК, оверэкспрессия, а также доставка терапевтических молекул различными векторами) не только теоретически, но и проанализировать in vitro. Учитывая распространенность миодистрофий, зачастую «труднодоступность» пациентов, многообразие мутаций и форм заболеваний, взятие биоптата для выделения и культивирования клеток в условиях лаборатории зачастую весьма затруднительно, или невозможно. Кроме этого, для создания молекул, действующих целенаправленно, на определенный участок ДНК или РНК, требуются образцы клеток, имеющих соответствующую мутацию. Таким образом, необходимо создание клеточных тест-систем (моделей заболеваний) в условиях лаборатории из уже имеющегося или легкодоступного биоматериала. Наиболее оптимальным сегодня является применение системы геномного редактирования CRISPR\Cas9. Нами выполнен дизайн молекулярного инструмента и получены лентивирусные частицы, содержащие систему CRIPSR\Cas9-SAM, несущую в своем составе белки, позволяющие осуществить транскрипционную активацию, с помощью которой в фибробластах, полученных от пациента с поясно-конечностной мышечной дистрофией 2Б (дисферлинопатией) с мутацией в 26 экзоне гена, кодирующего мышечный белок дисферлин (DYSF) будет активирован ген DYSF для дальнейшей оценки действия геннотерапевтических молекул. Кроме этого, мы выполнили дизайн и получили лентивирусные частицы с системой CRIPSR\Cas9, а также донорские ДНК, содержащие участок с мутацией, идентичной той, что имеется у пациентов, проживающих в труднодоступном регионе. С помощью лентивирусного вектора нами осуществлено моделирование мутации в 3 экзоне гена DYSF (c. 573–574 TG>AT) в клетках HEK293T, впоследствии будет выполнена транскрипционной активацией гена DYSF при помощи CRIPSR\Cas9-SAM. Таким образом, нами будет получена in vitro тест-система для отработки точных молекулярных инструментов для редактирования ДНК и РНК, а также подходов, связанных с оверэкспрессией белка дисферлина.